抗原抗体工作浓度确定有哪些常见误区

ELISA实验中确定抗原抗体工作浓度，常见误区主要有这几个：

‌误区一：浓度越高越好‌
很多人觉得抗体浓度越高，检测信号就越强，结果越准。其实不然，浓度过高反而可能导致非特异性结合，背景升高，甚至出现“钩状效应”（高浓度抗原导致信号反而降低）。关键是要找到既能保证足够信号，又不会引起非特异性结合的最佳浓度。

‌误区二：完全依赖说明书稀释比例‌
说明书上的稀释比例是个参考范围，但不同批次抗体的效价和活性可能有差异，盲目套用不一定适用。最稳妥的做法是进行预实验，通过棋盘滴定法（Checkerboard Titration）来优化，即测试不同抗原和抗体浓度组合，选择信噪比最高的配比。

‌误区三：忽视抗体回收利用‌
有些实验人员会回收稀释后的抗体重复使用，但这可能导致抗体效价下降、缓冲体系改变，进而影响实验结果的重现性。除非是经过验证的高稳定性抗体（如某些内参抗体），否则不建议回收使用。

‌误区四：忽略抗体保存方式‌
抗体的保存方式直接影响其活性。反复冻融是大忌，会导致抗体变性失活。正确的做法是收到抗体后先离心，再根据抗体类型（即用型通常4℃保存，含甘油的抗体-20℃保存）分装保存，避免反复冻融。

‌误区五：稀释操作不规范‌
稀释抗体时，移取极少量原液（如<1μL）会导致误差被放大，多次倍比稀释则可能因抗体吸附在管壁上造成浓度不准。建议使用校准过的移液器，采用直接稀释法，并确保充分混匀。

‌误区六：不进行预实验直接用于正式实验‌
跳过预实验直接使用“经验浓度”是另一个常见误区。不同实验体系、不同批次试剂都可能需要重新优化浓度。务必通过预实验确定最佳工作浓度，这是保证ELISA结果准确可靠的关键步骤。

总之，确定抗原抗体工作浓度需要科学的方法和严谨的态度，避免这些误区才能获得可靠的数据。