3T3-L1脂肪细胞诱导分化方案

3T3-L1细胞是一种从小鼠胚胎成纤维细胞中分离得到的细胞系，具有从快速分裂的前脂肪细胞向脂肪样细胞分化的特性。

对于诱导效果的检测有多种方式，其中油红O染色是检测脂肪细胞脂滴积累的经典方法，可用于直观评估细胞的脂肪化程度。油红O是一种脂溶性染料，能够特异性结合细胞内的中性脂质，形成红色的脂滴。可以在显微镜下观察脂滴的形成，当观察到脂滴数量和大小的增加则表明诱导分化成功。

        另外也可以通过分子标志物检测的方式来判断诱导效果，比如通过检测脂肪细胞特异性基因或蛋白的表达，评估细胞的分化程度。常用的基因标志物包括PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）、aP2（脂肪细胞脂肪酸结合蛋白）、LPL（脂蛋白脂肪酶）等。或者通过Western Blot检测基因所对应的蛋白表达水平。此外，诱导分化后的3T3-L1细胞形态会发生显著变化，细胞内出现大量脂滴。此形态学变化也可作为是否成功诱导的初步判断依据。

 

介绍3T3-L1细胞分化为脂肪样细胞的实验方案。

第 1 阶段   细胞培养

1.以每平方厘米3×103个细胞的密度将细胞接种于六孔板中。

       注意：

    （1）建议使用早代次的细胞进行实验，以确保分化效果。

    （2）铺板需均匀，铺板不均匀可能会导致分化不均匀，分化比例低，分化过程中细胞漂浮。

2.在DMEM中培养细胞，直至达到70%的汇合度，每2-3天更换一次培养基。

        3T3-L1细胞通常在DMEM高糖培养基中培养，加入10%小牛血清或胎牛血清以促进细胞生长。细胞在培养箱中（37℃，5% CO₂）生长至汇合度达到90%左右时，即可进行分化诱导。

        分化前的汇合度不应超过70%，否则会增加分化后的细胞死亡。

       注意：

    （1）使用高血清含量的培养基可以促进脂肪积累。

    （2）细胞密度是影响分化效果的关键因素，汇合度过高或过低都会影响分化效率。

第 2 阶段   分化诱导培养基配制

培养基制备必须在组织培养箱中无菌条件下进行。MDI（甲基异丁基黄嘌呤IBMX、地塞米松、胰岛素）诱导培养基和胰岛素培养基应新鲜制备。

实验步骤

1.制备储备溶液。

在DMSO中制备 IBMX（50 mM）和地塞米松（1 mM）的储备溶液。如果使用冻干胰岛素，请根据制造商的说明进行复溶。

2.配置100 mL MDI诱导分化培养基。

第3阶段 脂肪细胞维持与检测

当细胞完成MDI诱导后，需要更换为维持培养基继续培养。此时细胞开始进入脂肪积累阶段，这一过程通常需要7-10天。维持培养基的配制方法如下：
1. 在基础DMEM高糖培养基中加入10%胎牛血清
2. 补充1 μg/mL胰岛素
3. 每2-3天更换一次新鲜配制的维持培养基

注意事项：
（1）维持阶段需密切观察细胞状态，出现过度漂浮的细胞应及时更换培养基
（2）胰岛素浓度不宜过高，否则可能导致细胞过度增殖

第4阶段 分化效果评估

4.1 油红O染色操作流程：
1. 用PBS轻柔洗涤细胞3次
2. 4%多聚甲醛固定30分钟
3. 新鲜配制的油红O工作液染色1小时
4. 苏木素复染细胞核2分钟
5. 显微镜下观察并拍照记录

4.2 qRT-PCR检测关键基因表达：
推荐使用Trizol法提取总RNA后：
1. 设计PPARγ、aP2等基因的特异性引物
2. 设置GAPDH作为内参基因
3. 采用2-ΔΔCt法计算相对表达量

常见问题解决方案：
1. 分化效率低：检查细胞代次是否过高，诱导试剂是否失效
2. 细胞大量漂浮：降低诱导时的细胞密度，优化培养基更换频率
3. 脂滴形成不明显：延长维持培养时间至14天

本方案通过多阶段诱导和系统评估，可确保获得高质量的脂肪细胞模型。建议实验过程中做好详细记录，包括细胞状态照片、试剂批号等关键信息，以保证实验的可重复性。对于初次尝试的研究人员，建议设置阳性对照和阴性对照，以准确评估实验体系的可靠性。
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