质粒中量提取试剂盒操作方法

质粒中量提取试剂盒操作方法：
1. 取5-30 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，4,000 rpm 离心3 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2. 向有菌体沉淀的离心管中加入2 ml Solution I（已加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀，然后静置5 min。

注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3. 向离心管中加入2 ml Solution II，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间丌应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解丌彻底，应减少菌体量。

4. 向离心管中加入2.8 ml Solution III，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10 min。

注意：Solution III 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

5. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中 （吸附柱放入收集管中），注意尽量丌要吸出沉淀。12,000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

6. 可选步骤：向吸附柱中加入3.5 ml去蛋白液 Solution PE，12,000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步可省略。

7. 向吸附柱中加入3.5 ml DNA Wash Buffer（使用前请先检查是否已加入相应体积的无水乙醇），12,000 rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

8. 重复操作步骤7。

9. 将吸附柱放入收集管中, 12,000 rpm离心1 min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。

10. 将吸附柱开盖，置于室温放置3-5 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11. 将吸附柱置于一个干净的15ml离心管中，向吸附膜的中间部位滴加0.5-1.0 ml洗脱缓冲液Elution Buffer（或者ddH2O），室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min将质粒溶液收集到离心管中。注意：将洗脱缓冲液Elution Buffer（或者ddH2O）预热至60℃将有助于提高质粒洗脱的效果。